PCR ιών Monkeypox γρήγορη εξάρτηση δοκιμής πραγματική - χρόνος για τα ανθρώπινα δείγματα εκκριμάτων τραυμάτων ορών

Προδιαγραφή

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΕΣ

1. Προετοιμασίες δειγμάτων
Η εξαγωγή DNA από τα κλινικά δείγματα διευθύνεται σύμφωνα με τις αντίστοιχες απαιτήσεις και τις διαδικασίες στην εξάρτηση εξαγωγής DNA ιών. Εξαγμένη

Το DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί άμεσα για την ανίχνευση. Εάν το δείγμα δεν ανιχνεύεται αμέσως μετά από την εξαγωγή, πρέπει να αποθηκευτεί σε -70°C για την εφεδρεία, που αποφεύγει τους επαναλαμβανόμενους freeze-thaw κύκλους.

2. Προετοιμασία συστημάτων αντίδρασης
(1) προετοιμασία συστημάτων: Πάρτε έξω το αντιδραστήριο από την εξάρτηση, και επιτρέψτε σε το για να ξεπαγώσετε εντελώς στη θερμοκρασία δωματίου. Αναστρέψτε το μίγμα και υποβάλτε σε φυγοκέντρωση αμέσως. Οι αντιδράσεις δοκιμής Ν (Ν = αριθμός δειγμάτων που εξετάζονται + θετικός έλεγχος + αρνητικός έλεγχος + 1) προετοιμάζονται για τα συστήματα αντίδρασης, αντίστοιχα, ως εξής.

(2) διανομή συστημάτων αντίδρασης: Αναμίξτε καλά τον ανωτέρω απομονωτή αντίδρασης, υποβάλτε, και διανείμετε 15μL των υποπολλαπλάσιων σε φυγοκέντρωση PCR στους σωλήνες κατάλληλους για το φθορισμού PCR όργανο. (Υποβάλτε τους PCR σωλήνες σε φυγοκέντρωση σε 6,000rpm για τη δεκαετία του '30 και τη μεταφορά στη ζώνη επεξεργασίας δειγμάτων.)

3. Φόρτωση δειγμάτων (ζώνη επεξεργασίας δειγμάτων)
Προσθέστε το δείγμα νουκλεϊνικού οξέος 10μL, τον αρνητικό έλεγχο και το θετικό έλεγχο στους ανωτέρω PCR σωλήνες αντίστοιχα. Η ΚΑΠ οι σωλήνες στενά και υποβάλλει σε φυγοκέντρωση σε 6,000rpm για 10s και έπειτα τη μεταφορά PCR στη ζώνη ενίσχυσης.
* Προφύλαξη: Η προσθήκη των δειγμάτων στην ακόλουθη διαταγή είναι
συστημένος: αρνητικό δείγμα νουκλεϊνικού οξέος control-> - > θετικός έλεγχος.
 

4. PCR ενίσχυση (PCR ζώνη ενίσχυσης)
4.1 βάλτε PCR οι σωλήνες στη σε πραγματικό χρόνο PCR μηχανή για την ενίσχυση.
4.2 PCR φθορισμού ρύθμιση όρου κύκλων

Συλλέξτε τα φθορισμού σήματα στο βήμα 3:60℃ 35s για τη ABI 7500, η δεκαετία του '20 για slan-96S/96P, ενώ 13s για άλλο πραγματικό - χρονικό PCR συστήματα. Ο συνολικός όγκος: 25μL.

4.3 διάθεση μετά από την ανίχνευση
Διαθέστε τους PCR σωλήνες σε μια σφραγισμένη τσάντα μετά από την αντίδραση και επεξεργαστείτε τους χρησιμοποιημένους σωλήνες ως ιατρικά απόβλητα.
 

5. Τοποθετήσεις για την ανάλυση αποτελέσματος
Θέστε τη βασική γραμμή σε μια περιοχή πριν από την εκθετική ενίσχυση όπου τα φθορισμού σήματα όλων των δειγμάτων είναι σχετικά σταθερά (καμία σημαντική διακύμανση σε όλα τα δείγματα) θέστε την αφετηρία (αριθμός κύκλων) μακρυά από τις διακυμάνσεις σημάτων στην έναρξη
φάση συλλογής φθορισμού θέστε στο τελικό σημείο (αριθμός κύκλων) 1~3 κύκλους πριν από το CT του πρώτου δείγματος για να εισαγάγετε την εκθετική ενίσχυση. 4~15 κύκλοι συστήνονται.
Θέστε το δικαίωμα κατώτατων ορίων επάνω από το υψηλότερο σημείο της αρνητικής καμπύλης ενίσχυσης ελέγχου (ανώμαλη καμπύλη θορύβου).
 

6. Κριτήρια ποιοτικού ελέγχου
Πριν από την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων δειγμάτων, ο θετικός έλεγχος και ο αρνητικός έλεγχος πρέπει να ερμηνευθούν χρησιμοποιώντας τον πίνακα ερμηνείας κατωτέρω, και ο θετικός έλεγχος και η αρνητική καμπύλη ελέγχου πρέπει να εκτελεσθούν σωστά, διαφορετικά το αποτέλεσμα δειγμάτων είναι άκυρο.

7. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής
Τα κανάλια FAM για τον ιό Monkeypox, αποτέλεσμα ανίχνευσης πρέπει να ερμηνευθούν όπως κατωτέρω.
α) θετικό: Το CT ≤ 38 και η καμπύλη ενίσχυσης είναι S-shaped.
β) πιθανός: 38 < Ct=""> 40 ή μηδενικό CT και CT ≤ 35 VIC στο κανάλι για τη δεύτερη δοκιμή.
γ) αρνητικός: CT > 40 ή μηδενικό CT και CT ≤ 35 VIC στο κανάλι.
δ) επανελέγξτε: CT > 40 ή μηδενικό CT και CT > 35 VIC στο κανάλι.